Immunophénotypage du tissu adipeux épicardique chez des patients à haut risque cardiovasculaire

Proposition sujet de thèse

Equipe 2 - Thrombose plaquettes et désordres vasculaires

Nom

Bénédicte Gaborit

Grade

PUPH

Courriel

Benedicte.gaborit@ap-hm.fr

Téléphone

04 91 96 87 23

Méthodes

Caractérisation des cellules immunitaires dans le TAEhumain

Les cellules immunitaires seront isolées du TAE et du TA sous-cutané thoracique obtenus lors d’une chirurgie cardiaque chez des patients opérés à coeur ouvert (remplacement de la valve, pontage coronarien ou transplantation cardiaque. La composition, le phénotype, le profil de sécrétion et l'état d'activation des cellules isolées avec ce protocole seront évalués selon plusieurs méthodes, notamment la cytométrie en flux multiparamétrique (Brestoff, 2017). Les macrophages, les éosinophilesetlesdifférentessous-populationsdecelluleslymphoidesinnées(ILC) seront également identifiés et comparés entre le TAE et le TA sous-cutané thoracique.Eneffet,derécentesétudesindiquentquelesILC2régulentl'activation des adipocytes beiges et bruns (Brestoff et al., 2015). En outre, d’autres données suggèrent que les ILC1 pourraient également réguler l'homéostasie des macrophages (Boulenouar et al., 2017). L’étudiant en thèse sélectionné devra analyser le phénotype et l'état d'activation de ces cellules, ainsi que leurs interactions avec d'autres cellules immunitaires. Les ILC2 seront identifiés à l'aide de marqueurs de surface spécifiques (CD45int Lineage−CD25+IL-33R+).

Caractérisation des ASC dans le TAEhumain

Les ASC du TAE seront caractérisées, quantifiées et comparés aux cellules du TA sous-cutanéafindedéterminerleurorigineetleurrôleauniveaudumyocarde.Les ASC seront isolées à partir de la fraction stroma vasculaire (SVF) du TAE et seront caractérisées par cytométrie en flux en utilisant une combinaison de marqueurs de surface spécifiques CD34+ / CD90+ / CD73+ / CD140a+/ CD31- /CD45- (Maumus et al., 2011). Parallèlement, l'activité adipogénique des ASC provenant du TAE ou du TA sous-cutané sera testée et comparée in vitro. L’impact du profil immunitaire des SVF sur la différenciation des ASC et sur son brunissement sera étudié, en particulier l'effet des interleukines IL15 et IL13 sécrétées par les ILC2. Il est particulièrement important de déchiffrer ces stimuli adipogéniques pouvant transformer le TAE en raison de sa proximité anatomique avec l'interface épicarde- myocarde. En effet, l'accumulation et les dysfonctions des adipocytes épicardiques ont une influence sur les vaisseaux coronaires sous-jacents, les oreillettes et le muscle ventriculaire, pouvant être à l’origine d’un remodelage de la matrice extra cellulaire du myocarde sous-jacent. Nos travaux préliminaires montrent que les adipokines sécrétées par le TAE humain et en particulier l’activin A sont capables d’induire une fibrose du myocarde de rat (Venteclef et al., 2015). L’étude des ASC duTAEpermettrademieuxcomprendrelesfacteursassociésaudéveloppementde ce tissu ectopique, à l’acquisition de son phénotype beige oubrite.

Association entre les profils immunitaires du TAE des donneurs et le résultat de la transplantation cardiaque

La transplantation cardiaque est le traitement de référence de l'insuffisance cardiaque en phase terminale. La vasculopathie par allogreffe cardiaque (VAC) est unecomplicationmajeurelimitantlasurviedugreffonetdupatient(Edwardsetal., 2018). L'âge du donneur ou la qualité du cœur greffé sont des facteurs majeurs associés à l'échec de la greffe. La qualité du réseau vasculaire et l'infiltration de cellules immunitaires favorisant l'inflammation du coeur du donneur jouent un rôle crucial dans l'activation chronique de la réponse allo-immune du receveur au greffon.

L’équipe de Pascale Paul qui est chercheur Insermau C2VN amontréque l'activation des cellules NK du receveur est un facteur prédictif majeur du VAC (Paul et al., 2018). Nous avons également obtenu au C2VN des preuves préliminaires qu'un profil pro-inflammatoire spécifique peut être caractérisé dans le TA périrénal de donneurs ayant reçu une greffe de rein avec des facteurs de comorbidité cardiovasculaire. Nous analyserons donc si le profil immunitaire et sécrétoire des cellules immunitaires du TAE du cœur greffé peut constituer un paramètre prédictif pour des résultats défavorables après une transplantation cardiaque. Ce modèle aidera à comprendre l'inter-relation entre le TAE et la survenue de pathologies cardiaques.

Il est désormais reconnu que la répartition régionale du tissu adipeux (TA) est l’un desparamètresclésdansl’hétérogénéitédesdysfonctionsmétaboliquesdel’obésité et du risque cardiovasculaire associé. Ainsi, l’incapacité chez certains individus à stockerlesgraissesenexcèsdansleTAsous-cutanéentrainelaformationdedépôts ectopiques de graisses notamment au niveau du coeur. Ce dépôt de graisse appelé tissu adipeux épicardique(TAE)formeunorganeendocrinienmétaboliquementactif quientourelemyocardeetmodulesastructureetsafonction(Gaboritetal.,2017). Deparsalocalisationanatomiqueuniqueentrelepéricardeviscéraletlemyocarde, les adipocytes du TAE communiquent avec les cardiomyocytes et les cellules de la paroi vasculaire. Des études cliniques rapportent que le TAE est associé à l’apparitiondepathologiescardiovasculairesetàleursévérité(Dutouretal.,2010). En effet, le TAE est positivement corrélé à la survenue d’événements coronariens et defibrillation auriculaire (Mahabadietal.,2013).Ilaétémisenévidencequele TAE avait un profil adipocytaire beige et sécrétant des facteurs pro-inflammatoires et fibrotiques (Gaborit et al., 2015). En revanche, les mécanismes entraînant la formation du TAE, contrôlant sa mobilisation, son profil inflammatoire et métabolique, ainsi que la caractérisation de sa fraction vasculaire stromale (SVF) restent encore à élucider. Nos travaux préliminaires suggèrent que le phénotype immuno inflammatoire du TAE, plus que sa quantité pourrait participer à la survenue d’évènements coronaires et à la survenue de rejet de greffon cardiaque.

NotrehypothèseestquelafractionstromavasculaireduTAEestforméedecellules souches adipeuses et de cellules immunitaires qui participent à la modification du phénotype immunométabolique du TAE, et participeraient à la pathogénèse de la maladie coronaire, et du rejet de greffe cardiaque. Certaines expériences chez la souris suggèrent que le TAE pourrait avoir une origine épicardique (Chau et al.,2014). Nos travaux préliminaires sont en faveur d’une autre hypothèse qui est que le TA sous-cutané périphérique, lors d’une balance énergétique positive ou un régime hyperlipidique pourrait libérer des progéniteurs adipeux (cellules souches adipeuses, ASC) dans la circulation, ces derniers se différencient en adipocytes. En effet, l’expansion du TA sous-cutané chez des souris obèses entraîne la libération systémique d’une sous-population de cellules souches adipeuses et leurs dépôts ectopiques via un mécanisme impliquant la chimiokine CXCL12 ainsi que son récepteur CXCR4 (Gil-Ortega et al., 2013). Il a également été montré que la chimiokinefractalkine CX3CL1 et son récepteur CX3CR1 jouent un rôle essentiel dans le recrutement, l’infiltration et l’activation pro-inflammatoire, fibrotique et cytotoxique des leucocytes. Cependant, leur implication dans la genèse de l’inflammation métabolique reste à démontrer. En utilisant une approche pangénomique,notregroupeadémontréqueleTAEavaitunprofiltranscriptomique unique et une signature adipocytaire beige (Gaborit et al., 2015). Les adipocytes beige sont des adipocytes situés dans des îlots de tissu adipeux blanc, qui ont la capacitéderecruteretd’exprimerlaprotéineUCP-1(un coupling protein1).Il a été suggéré que le phénotype beige du TAE provenait du recrutement d'adipocytes blancs susceptibles d’exprimer UCP-1 en réponse à des facteurs thermogéniques. Cependant, ce qui régule ce phénomène reste à clarifier. Est-ce que les cellules immunitaires de la fraction stroma vasculaire du TAE sont capables d’induire ou de réprimer une beigisation du TAE est une hypothèse originale qui n’a pas encore été testée à ce jour.

Dans ce contexte, l’objectif du doctorant sélectionné sera d’identifier les mécanismes à la base du développement et du remodelage du TAE et son impact dans la survenue d’évènements coronariens, rythmiques et du rejet de greffe cardiaque. Pour cela, nous déterminerons le profil immunitaire et sécrétoire de la fraction vasculaires tromale(SVF)duTAE(cellules immunitaires et cellules souches adipeuses (ASC)) chez des patients à haut risque cardiovasculaire opérés à cœur ouvert.

Résultats attendus

La preuve de concept apportée par le présent projet est nécessaire d'un point de vue clinique et permettra d'identifier des cibles thérapeutiques afin de développer de nouveaux médicaments ayant pour cible les cellules immunitaires du TAE. Ce projet est novateur en ce sens que les dépôts de graisse ectopiques et le tissu adipeux épicardique connaissent un intérêt grandissant dans la communauté scientifique mais aucune étude n'a identifié jusqu'alors le profil immunitaire et les cellulessouchesadipeusesdecetissu.Nousnousattendonségalementàcequece projetpuissedéfinirlesfacteursliésaudonneurquireflètentetprédisentlesprofils pro-inflammatoires associés à la qualité du coeur du donneur et au résultat de la transplantation. Ces paramètres pourraient donc consister en des marqueurs physiopathologiques et prédictifs d'évènements cardiaques. Enfin, les équipes de recherche impliquées dans ce projet de recherche (Stromalab à Toulouse, C2VN à Marseille, IMMEDIAT Paris) on tu ne expertise reconnue dans le domaine des dépôts de lipides ectopiques, de l'inflammation, de l'immunométabolisme et des cellules souchesadipeusesetontdéjàpubliédesarticlesscientifiquesencollaboration.Elles garantissent la qualité scientifique et la faisabilité du projet de rechercheproposé.

Profil du candidat demandé

La thèse sera réalisée sous la direction de Bénédicte Gaborit, Professeur en physiologie endocrinienne auC2VN
Des connaissances en cytométrie en flux ainsi qu’une expérience en immunologie seront fortement appréciées. Des connaissances en médecine et en métabolisme humain sont également souhaitables afin de mener à bien ce projet aux compétences interdisciplinaires indispensables

Boulenouar,S.,Michelet,X.,Duquette,D.,Alvarez,D.,Hogan,A.E.,Dold,C.,etal. (2017). Adipose Type One Innate Lymphoid Cells Regulate Macrophage Homeostasis through Targeted Cytotoxicity. Immunity 46:273–286.

Brestoff,J.R.,Kim,B.S.,Saenz,S.A.,Stine,R.R.,Monticelli,L.A.,Sonnenberg,G.F., etal.(2015).Group2innatelymphoidcellspromotebeigingofwhiteadiposetissue and limit obesity. Nature 519:242–246.

Brestoff, J.R. (2017). Isolation of Immune Cells from Adipose Tissue for Flow Cytometry. Methods Mol. Biol. Clifton NJ 1566:49–59.

Chau,Y.-Y.,Bandiera,R.,Serrels,A.,Martínez-Estrada,O.M.,Qing,W.,Lee,M.,et al. (2014). Visceral and subcutaneous fat have different origins and evidence supports a mesothelial source. Nat. Cell Biol. 16:367–375.

Dutour A, Achard V, Sell H, Naour N, Collart F, Gaborit B, Silaghi A, Eckel J, Alessi MC, Henegar C, Clément K. Secretory type II phospholipase A2 is produced and secreted by epicardial adipose tissue and overexpressed in patients with coronary artery disease. J ClinEndocrinolMetab. 2010 Feb;95(2):963-7. doi: 10.1210/jc.2009-1222. Epub 2009 Dec11.

Edwards,L.A.,Nowocin,A.K.,Jafari,N.V.,Meader,L.L.,Brown,K.,Sarde,A.,etal. (2018). Chronic Rejection of Cardiac Allografts Is Associated With Increased Lymphatic Flow and Cellular Trafficking. Circulation 137:488–503.

Gaborit, B., Venteclef, N., Ancel, P., Pelloux, V., Gariboldi, V., Leprince, P., et al. (2015). Human epicardial adipose tissue has a specific transcriptomic signature depending on its anatomical peri-atrial, periventricular, or peri-coronary location. Cardiovasc. Res. 108:62–73.

Gaborit, B., Sengenes, C., Ancel, P., Jacquier, A., and Dutour, A. (2017). Role of Epicardial Adipose Tissue in Health and Disease: A Matter of Fat? Compr. Physiol. 7:1051–1082.

Gil-Ortega, M., Garidou, L., Barreau, C., Maumus, M., Breasson, L., Tavernier, G., et al. (2013). Native adipose stromal cells egress from adipose tissue in vivo: evidence during lymph node activation. Stem Cells Dayt. Ohio 31:1309–1320.

Mahabadi, A.A., Berg, M.H., Lehmann, N., Kälsch, H., Bauer, M., Kara, K., et al. (2013). Association of epicardial fat with cardiovascular risk factors and incident myocardial infarction in the general population: the Heinz Nixdorf Recall Study. J. Am. Coll. Cardiol. 61:1388–1395.

Maumus, M., Peyrafitte, J.-A., D’Angelo, R., Fournier-Wirth, C., Bouloumié, A., Casteilla, L., et al. (2011). Native human adipose stromal cells: localization, morphology and phenotype. Int. J. Obes. 2005 35:1141–1153.

Paul, P., Picard, C., Sampol, E., Lyonnet, L., Di Cristofaro, J., Paul-Delvaux, L., et al. (2018). Genetic and Functional Profiling of CD16-Dependent Natural Killer Activation Identifies Patients at Higher Risk of Cardiac Allograft Vasculopathy. Circulation 137:1049–1059.

Venteclef, N., Guglielmi, V., Balse, E., Gaborit, B., Cotillard, A., Atassi, F., et al. (2015). Human epicardial adipose tissue induces fibrosis of the atrial myocardium through the secretion of adipo-fibrokines. Eur. Heart J. 36:795-805a.